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                                                      食品安全問題

                                                      霉變谷物中毒

                                                      黃曲霉毒素B1(AFB1)酶聯免疫定量檢測試劑盒使用說明
                                                      方法編號:CDC-5511

                                                        本測試盒用間接競爭免疫分析法定量測定谷物中AFB1。該 測試盒反應孔可拆卸,可測單份樣品,也可測多份樣品。定量分析時需有 含450nm波長的微孔板酶標儀。

                                                      1 概要
                                                        黃曲霉毒素是由曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產生的次 級代謝產物,主要污染玉米、花生、堅果等。天然污染的黃曲霉毒素以AFB1 為主,AFB1屬于強烈致癌物質,肝臟是其主要的靶器官, 具有極強的急性毒性和致癌性。
                                                        AFB1檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法 (HPLC)和ELISA方法,本試劑盒是以應用單克隆抗體為基礎的ELISA檢測方 法,可以準確快速檢測糧谷類和花生及飼料中的AFB1。

                                                      2 測定原理
                                                        本試劑盒采用固相酶聯免疫吸附原理,利用間接競爭ELISA 法進行測定。用抗原包被微孔板,加入AFB1標準品或樣品、抗AFB1單克隆 抗體進行孵育后,將未與包被抗原結合的抗體洗去;再加入酶標記的抗鼠 IgG抗體孵育,加入顯色液,經過終止液終止后, 用酶標儀在450nm處測定OD值。

                                                      3 提供的物品
                                                      ----微孔板…………………………………………………………… 包被有AFB1-BSA
                                                      ----5個濃度的AFB1標準溶液(各0.5mL)

                                                      標準1:0ng/mL…………………………………………………………….直接使用
                                                      標準2:0.1ng/m…………………………………………………………….直接使用
                                                      標準3:0.2ng/mL ………………………………………………………….直接使用
                                                      標準4:0.5ng/m………………………………………………….…………直接使用
                                                      標準5:1.0ng/m………………………………………….…………………直接使用

                                                      ----抗AF B1單克隆抗體溶液(6mL)……………………………………………直接使用
                                                      ----酶標物(12mL)..………………………………………………………………直接使用
                                                      ----顯色液(12mL)..………………………………………………………………直接使用
                                                      ----終止液(6mL)…………………………………………………………………直接使用
                                                      ----濃縮洗液(30mL)..……………………………………………………………稀釋使用

                                                      4 盒中未提供,需自備物品
                                                      ----微孔板酶標儀(可于450nm處測定)、振蕩器、粉碎機、微量移液器
                                                      ----量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙
                                                      ----氯化鈉(分析純)、甲醇(分析純)、去離子水或蒸餾水

                                                      5 操作者注意事項
                                                      ----標準溶液中含有黃曲霉毒素,應特別小心。
                                                      ----使用過的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液最好用pH7的次氯酸溶液 (10%v/v)浸泡過夜。
                                                      ----終止液含有硫酸,避免接觸皮膚。
                                                      ----每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。
                                                      ----每步加樣時間應控制在5min內。
                                                      ----孵育過程中應避光。
                                                      ----不要使用過期試劑盒。
                                                      ----不要交叉使用不同批號的試劑盒中的試劑。

                                                      6 儲存條件
                                                      ----保存試劑盒于2~8℃。不要冷凍.
                                                      ----顯色液對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
                                                      ----將不用的微孔板放進原鋁箔袋中,置2~8℃保存。

                                                      7 試劑變質的標志
                                                      ----標準1的吸光度值小于0.5個單位(A450nm<0.5)時, 表示試劑可能變質。

                                                      8 樣品處理
                                                      ----樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存。
                                                      ----取5g粉碎的有代表性的樣品, 加1.25g氯化鈉及25mL70%甲醇-水溶液。
                                                      ----強力振蕩3分鐘。
                                                      ----用快速定性濾紙過濾。
                                                      ----取1mL濾液,加水4mL進行稀釋。
                                                      ----取50μL稀釋液進行分析。
                                                      ----*根據需要可以增減樣品量,但甲醇-水溶液的量也應相應增減。

                                                      9 酶免疫分析程序
                                                      ----濃縮洗液為10倍濃縮液, 使用時與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。
                                                      ----取所需數量的板條插入微孔架,用洗液洗滌微孔板3min×2次。
                                                      ----加入50mL標準品或處理好的樣品到微孔,記錄樣品及標準的位 置,每個標準和樣品必須使用新的吸頭。
                                                      ----加入50mL抗體溶液到每個微孔(注意移液器管尖不要接觸到孔 中的液體,避免交叉污染)中,37℃孵育90min。
                                                      ----甩掉孔中液體,用洗液洗滌微孔板3min×3次,最后一次應在吸 水紙上拍打以完全除去孔中液體。
                                                      ----每孔加入酶標物100mL,37℃孵育60min。
                                                      ----用洗液洗滌微孔板3min×5次,最后一次應在吸水紙上拍打 以完全除去孔中液體。
                                                      ----每孔加入顯色液100mL(2滴),37℃孵育10~12min。
                                                      ----每孔加入終止液50mL(1滴),立即用酶標儀在波長450nm 處測定吸光度值(OD值)。
                                                      注:在定量分析中,顯色液和終止液需要用移液器準確量取。

                                                      10 樣品濃度計算
                                                        以標準溶液OD值與標準1OD值的比值為縱坐標,所對應 標準溶液濃度(ng/mL)的對數值為橫坐標,制作標準曲線。根據樣品 OD值與標準1OD的比值,可從曲線上得到對應點的橫坐標,即為AFB1濃 度的對數值,求得反對數即為測定液中AFB1濃度C(ng/mL),按下列公 式計算出樣品中AFB1含量: AFB1含量(mg/kg)= C×K
                                                      式中:C:稀釋后樣品提取液中AFB1含量(ng/mL)
                                                      K:樣品稀釋倍數(按照本說明書中樣品處理程序方法為25)

                                                      11試劑盒主要技術指標及參數
                                                        測試盒最低檢出濃度0.1ng/mL,回收率70%~120%,與 AFB2的交叉反應系數小于1%,與AFG1的交叉反應系數為4.65%, 與AFG1交叉反應系數小于1%。試劑盒校正曲線的線性范圍 0.1~1.0ng/mL,試劑盒條內變異<10%,條間變異<15%。

                                                      附圖 (僅供參考)

                                                      AFB1毒素濃度對數(ng/mL)

                                                      京ICP備20024968號     北京中衛永晟科技有限公司
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